Norma
Bonaccorso
Mestranda
em Medicina Forense na FDUSP
Bacharel
em Ciências Biológicas e em Direito pela USP
Perita
Criminal dos Laboratórios de Toxicologia e de DNA do Instituto de Criminalística
do Estado de São Paulo
Professora
das disciplinas de Criminalística, Toxicologia e de Identificação Humana
pelo DNA da Academia de Polícia de São Paulo
Monografia
apresentada em 2000 no Concurso de Ingresso para Professor da ACADEPOL e
atualizada em 2004
Sumário: 1. Introdução. 1.1. Aspectos históricos.
1.1.1. Vantagens do DNA sobre a sorologia tradicional. 1.2. O
DNA. 1.2.1. Aspectos estruturais. 1.2.2. Transmissão da
informação genética. 1.2.3. Regiões hipervariáveis. 1.2.3.1. Tipos
de polimorfismos. 1.2.3.2. Métodos de detecção. 2.
Objetivos. 3. Procedimentos técnicos para análise de DNA. 3.1.
Coleta de materiais. 3.2. Extração do DNA. 3.3. Quantificação
do DNA extraído. 3.4. Amplificação do DNA. 3.5. Análise
Comparativa. 3.6. Cálculos estatísticos. 3.7. Elaboração
de laudo ou relatório. 4. Resultados. 5. Comentários. 6. Referências
bibliográficas.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos históricos
O
processo de recombinação gênica proporciona um alto grau de variabilidade
entre os organismos vivos. Cada indivíduo da espécie humana possui um
perfil genético único, com exceção de gêmeos monozigóticos que
compartilham do mesmo genótipo.
Inúmeras
características hereditárias humanas permitem aferir, até certo grau,
esta individualidade genética, fato este de importância forense.
Há
bem pouco tempo a ciência da investigação de paternidade e da identificação
de casos criminais pautava-se apenas nas análises sorológicas dos
polimorfismos de proteínas e grupos sangüíneos e em alguns marcadores genéticos.
O
exame forense de amostras biológicas teve seu início por volta do princípio
do século XX com a aplicação dos grupos sangüíneos ABO em evidências
relacionadas a crimes ou à identificação de pessoas. Hoje, os grupos sangüíneos
eritricitários, como os sistemas ABO, Rh (CcDEe) e MNSs, foram substituídos
na maioria dos centros, sendo pouco utilizados.
Marcando
uma segunda fase na evolução desta ciência, em 1954, foi demonstrada a
ocorrência de um sistema de histocompatibilidade mediado por antígenos na
superfície dos leucócitos, conhecido por complexo HLA (histocompatibility
leucocyte antigen), determinado por genes alélicos muito próximos
localizados no braço curto do cromossomo 6, com acentuado poder de
discriminação individual ou determinação da individualidade genética
(CALABREZ, 1999).
A
terceira fase do desenvolvimento das ciências forenses voltadas à
identificação humana veio com a publicação de um artigo na Revista Nature,
por JEFFREYS et alii (1985a), sobre certas regiões de minissatélites
do genoma humano que produziam uma espécie de “impressões digitais” de
DNA.
A
tipagem molecular de material genético foi utilizada oficialmente pela
primeira vez, em 1985, por Jeffreys, na Inglaterra para a resolução de um
problema de imigração (JEFFREYS et
alii, 1985c).
Um ano após, o mesmo autor empregou esta técnica para identificar o
verdadeiro estuprador e assassino de duas vítimas. A partir deste caso, que
ficou conhecido como Enderby (Queen v. Pitchfork), a
Criminalística e a Medicina Legal ganharam novo fôlego e têm empregado a
técnica de tipagem molecular de DNA como potente arma no esclarecimento de
diversos delitos e na identificação humana (MOURA-NETO, 1998).
1.1.1 Vantagens do DNA sobre a sorologia tradicional
No aspecto forense, a caracterização do
material biológico tem por objetivo limitar ou reduzir o número de indivíduos
que poderiam ser a fonte do material. A população sob suspeita algumas
vezes é limitada ou muito próxima, permitindo assim a resolução mesmo
com marcadores genéticos de baixo poder discriminatório. Contudo, nos
casos em que a população não é limitada pelas circunstâncias do caso,
os métodos de maior poder discriminatório tornam-se recursos importantes.
A sorologia convencional (sistemas ABO, Rh, MN, PGM, HLA, entre outros) pode
rotineiramente gerar números de apenas um em dois ou um em alguns milhares.
Com o estudo do DNA, o poder discriminatório pode atingir o limite necessário
para inferir a identificação (KIRBY, 1992).
Várias vantagens do DNA sobre a
sorologia tradicional foram descritas por WEEDN & SWARNEN (1998). A
primeira e principal delas reside na possibilidade de sua aplicação sobre
toda e qualquer fonte de material biológico. Uma ampla variedade de líquidos
corporais é encontrada nos exames de evidência; todavia um exame sorológico
completo pode ser realizado somente no sangue e não em outros tecidos ou líquidos
corporais. Entretanto, com estudos de DNA qualquer quantidade traço de
qualquer material biológico, incluindo o sangue, cabelos, saliva sêmen,
tecido, urina ou qualquer outro fluido biológico, pode ser analisada para
associar um suspeito ao crime.
A segunda e mais amplamente propalada
vantagem do exame de DNA é seu potencial discriminatório. Em alguns casos,
os estudos de DNA podem revelar a identificação positiva, comparativamente
aos exames envolvendo o grupo sangüíneo ABO, que tem a capacidade de
discriminar aproximadamente um em três indivíduos na população geral, e,
mesmo com marcadores sorológicos adicionais, os valores típicos são de um
em alguns milhares, enquanto que com o DNA, os valores podem chegar a um em
alguns bilhões ou mais.
A sensibilidade do exame de DNA constitui
a terceira grande vantagem deste método. A tipagem do polimorfismo do DNA
através da reação em cadeia da polimerase (PCR), que estudaremos mais
adiante, pode ser efetuada com o DNA de algumas poucas células, de longe
superando a sensibilidade dos exames tradicionais.
A quarta vantagem do DNA é sua resistência
aos fatores ambientais. O DNA é uma molécula robusta, relativamente
resistente aos ácidos, álcalis e detergentes, diferentemente dos
determinantes protéicos, lipídicos e carboidratos. As proteínas podem ser
desnaturadas de forma relativamente mais fácil e sua estrutura terciária
conformacional, que é importante na tipagem, é facilmente desnaturável. A
informação da tipagem do DNA, por sua vez, é encontrada na seqüência
nucleotídica, que independe da conformação da molécula. Conseqüentemente,
os exames com DNA, diferentemente dos marcadores sorológicos tradicionais,
podem ser realizados com maior segurança em amostras muito antigas e que
estiveram expostas a maiores agressões ambientais.
Finalmente, a quinta vantagem do DNA
reside na possibilidade de se separar o DNA da célula espermática de
qualquer outro DNA celular. Um dos problemas históricos nos casos de evidência
de violência sexual é a presença, quase que exclusivamente, de uma
mistura de sêmen e outro líquido corporal, o que representa um problema sério
para os exames sorológicos tradicionais de tipagem, pois em aproximadamente
dois terços dos casos, não há possibilidade de se identificar o sêmen do
doador pelo fato de a mistura dos fluidos biológicos resultar em uma
mistura de tipos sorológicos (DAVIES, 1982). Todavia o DNA do esperma pode
ser separado de DNA não-espermático por lise diferencial, o que permite a
individualização da fonte do sêmen, sem que se confunda com os dados de
evidências do não-sêmen.
1.2 O DNA
1.2.1 Aspectos estruturais
Os ácidos nucléicos foram descobertos,
em 1869, por Friedrich Miescher, um médico suíço de 22 anos de idade.
Através de técnicas, notavelmente avançadas para a época, Miescher
isolou, dos núcleos de células de pus e de esperma de salmão, uma
macromolécula, nunca antes identificada, à qual deu o nome de nucleína.
Posteriormente a nucleína foi denominada ácido nucléico. No início do século
XX o bioquímico Kossel evidenciou a existência de dois tipos de ácidos
nucléicos: o ácido desoxirribonucléico (ADN ou DNA) e o ácido ribonucléico
(ARN ou RNA) (GRIFFITHS et
alii, 2000).
Os ácidos nucléicos são moléculas da
mais elevada importância para os seres vivos, dado que controlam os
processos vitais de todos os organismos. O DNA representa o gene, enquanto
que o RNA serve como agente intermediário na atividade do gene. (ALBERTS
et alii, 2000).
Os ácidos nucléicos são polinucleotídeos,
isto é, macromoléculas formadas pelo encadeamento de unidades chamadas de
nucleotídeos. Por sua vez, cada nucleotídeo resulta da combinação de três
componentes: fosfato, açúcar e base nitrogenada.
No DNA as bases nitrogenadas são a
adenina (A), a guanina (G), a citosina (C) e a timina (T).
O DNA é formado por duas cadeias de
polinucleotídeos enrolados de forma helicoidal e ligados transversalmente
através de pontes de hidrogênio. A adenina forma especificamente pontes
com a timina; e a guanina com a citosina. Para cada nucleotídeo de adenina
existe um de timina (A - T), e para cada nucleotídeo de guanina existe um
de citosina (G - C), formando duas cadeias que são designadas por
complementares.
James Watson e Francis Crick propuseram, em 1953, um modelo helicoidal para
a estrutura do DNA, baseados em estudos de difração de raios X. Tal modelo
pode ser assim esquematizado (JOBIM et
alii, 1999):
In vivo, o DNA se replica
ou duplica através de um processo chamado de semiconservativo. Sob a ação
de uma enzima específica, a DNA-polimerase, ocorre a quebra de pontes de
hidrogênio e a conseqüente separação das duas cadeias. Ao mesmo tempo
cada cadeia vai completando a sua cadeia complementar através do
encadeamento de novos nucleotídeos. O resultado é a formação de duas
cadeias que conservam, em sua estrutura, uma metade da molécula-mãe. Dada
esta forma de replicação, tem-se a designação semiconservativo
(ALBERTS et alii, 2000).
O DNA é encontrado principalmente no núcleo
das células e nas mitocôndrias (GRIFFITHS et
alii, 2000).
As mitocôndrias são corpúsculos esféricos
ou em forma de bastonetes, relacionados com a respiração celular, que
aparecem imersos no citoplasma. São encontradas em todas as células de
organismos eucariotos aeróbios. A quantidade de mitocôndrias por célula
varia em função de suas necessidades energéticas, sendo que uma única célula
pode chegar a possuir mais de 5.000 cópias desta organela (JOBIM et
alii, 1999).
As mitocôndrias são formadas pela divisão
de outras preexistentes. O processo acontece graças à existência de DNA
em seu interior. Este DNA é circular com regiões codificantes e uma região
hipervariável denominada controladora ou alça D, sendo esta última a região
utilizada para a identificação humana (LUTZ et alii,
1996).
A análise do DNA mitocondrial (mtDNA)
para fins forenses fica reservada para tecidos antigos como ossos, cabelos e
dentes dos quais o DNA nuclear já não oferece mais condições de análise
(VIGILANT et alii,
1989). Porém, por seu exame se dar pelo seqüenciamento direto de suas
bases nitrogenadas, técnica esta dispendiosa, por exigir o emprego de
tecnologia altamente especializada, e também pelo fato do mtDNA ser
unicamente matrilíneo (LUTZ et
alii, 1996) e, por isto, menos informativo, a análise do mtDNA não é
usual a todos os laboratórios forenses, voltados à elucidação de crimes
e à identificação de pessoas.
O núcleo controla todas as atividades
celulares, representando assim, o centro de coordenação celular, através
de seus ácidos nucléicos. É no DNA nuclear que estão localizados os
genes, depositários das informações genéticas responsáveis pelas
atividades da célula. Tais informações são transmitidas ao citoplasma
através do RNA mensageiro, que se origina do DNA, passa ao citoplasma e
comanda, através dos ribossomos, a síntese de proteínas específicas,
responsáveis pela estrutura e fisiologia celulares (ALBERTS et
alii, 2000).
Os genes fazem parte da estrutura
denominada cromossomo. Para facilidade de estudos, os cromossomos podem ser
considerados uma seqüência linear de genes.
1.2.2 Transmissão da informação genética
Os cromossomos ocorrem aos pares nas células
somáticas. Essas células são diplóides, isto é, possuem 2n
cromossomos. Os cromossomos que formam cada par são chamados de homólogos
(GRIFFITHS et alii,
2000).
Cada espécie tem um número de cromossos
constante. Na espécie humana, as células somáticas apresentam 46
cromossomos ou 23 pares de cromossomos homólogos (2n = 46).
Cada gene ocupa um lugar definido no
cromossomo, que é denominado lócus gênico. Os cromossomos homólogos que
formam cada par apresentam o mesmo lócus gênico (ALBERTS et
alii, 2000).
Quando, nas células de um indivíduo, os
genes que compõem um par não são idênticos entre si, o indivíduo é
denominado heterozigoto para o caráter determinado pelo par de genes e se
diz que os genes estão em heterozigose. Quando os genes alelos são idênticos,
o indivíduo é denominado homozigoto para aquele caráter e se diz que os
genes estão em homozigose (GRIFFITHS et
alii, 2000).
Na espécie humana, cada uma das células
somáticas, ao sofrer um processo de divisão chamado mitose, originará
duas outras células com 46 cromossos também. A mitose é um processo
importante no crescimento de organismos multicelulares e também nos
processos de regeneração de tecidos do corpo.
A meiose é um tipo de divisão em que
uma célula dá origem a quatro novas células com a metade do número de
cromossomos da célula inicial. Uma célula que apresenta 2n = 46
cromossomos, ao sofrer meiose, originará quatro células com n = 23
cromossomos. Este tipo de divisão ocorre no processo de formação de
gametas, em estreita relação com a 1ª lei de Mendel (GRIFFITHS
et alii, 2000).
Os trabalhos de Gregor Mendel resultaram
em leis fundamentais para a Genética atual. O enunciado da 1ª
lei de Mendel pode ser assim apresentado: "Cada caráter é determinado
por 'fatores' (genes) que se separam na formação dos gametas, indo um
'fator' do par para cada gameta" (ALBERTS et alii,
2000; MCKUSICK, 1992).
Em cada célula somática, a espécie
humana, como já dissemos, possui 46 cromossomos, sendo metade deles de
herança materna e a outra metade de herança paterna, oriundos,
respectivamente, de um óvulo e de um espermatozóide.
Uma pessoa possui bilhões e bilhões de
células em seu corpo e todas elas, com exceção de seus gametas, são, em
termos genéticos, idênticas. São cópias fiéis oriundas de uma única célula
2n (fusão do óvulo com o espermatozóide) que se multiplicou através do
processo de divisão celular chamado mitose. Deste modo, um indivíduo
carrega, em cada uma de suas células, as mesmas características genéticas
que foram herdadas de seus pais.
1.2.3 Regiões hipervariáveis
O objetivo da análise de DNA é
diferenciar um indivíduo de outro, através de um grande número de
características, dando-lhe uma identidade absoluta como pessoa, podendo
assim ser diferenciado dentre bilhões de outras.
A variabilidade humana em termos de DNA
é enorme. Dois genomas humanos escolhidos ao acaso diferem aproximadamente
em uma de cada 500 bases do DNA (nucleotídeos). Como o genoma humano tem
cerca de 3.109 de bases, isto implica em 6 milhões de diferenças
entre duas pessoas (LEE & GAENSSLEN, 1990).
Na espécie humana existem cerca de 50
mil genes que codificam, através de RNA, proteínas. Estes genes
codificadores de proteínas representam, aproximadamente, 10% do genoma.
Todo o restante trata-se de seqüências repetitivas que têm função
estrutural (PENA, 1997).
É a variabilidade deste restante, quais
sejam, as regiões hipervariáveis ou polimórficas, de função estrutural,
que se utiliza nos exames forenses de DNA.
De nada adiantaria comparar, por exemplo,
o gene codificador da insulina (hormônio protéico) de dois indivíduos
saudáveis, pois seriam absolutamente iguais. Muitas vezes, mutações
(variações nas bases nitrogenadas do DNA) genéticas, ao nível dos genes
codificadores de proteínas, podem levar à inviabilidade do indivíduo; ao
passo que mutações gênicas nas regiões estruturais têm sido toleradas,
ao longo da evolução humana, uma vez que não possuem função fisiológica
definida além da estrutural.
1.2.3.1 Tipos de polimorfismo
Os polimorfismos das regiões hipervariáveis
do DNA podem ser agrupados em dois tipos: polimorfismos de comprimento e
polimorfismos de seqüências.
Segundo WEEDN & SWARNEN (1998), “os
polimorfismos de seqüência, são compostos de diferentes nucleotídeos em
uma determinada localização do genoma. Estas variações em seqüência
podem ser manifestadas como regiões de alelos alternativos ou substituições,
adições ou deleções de bases, mas a maioria dos polimorfismos de seqüência
são meras mutações pontuais”.
Já os polimorfismos de comprimento são
seqüências de nucleotídeos que se repetem, sendo denominadas VNTRs (variable
number of tandem repeats) ou número variável de repetições
consecutivas (AMAR & AMAR, 1991; MOLLER & BRINKMANN, 1992).
As regiões com repetições da seqüência
básica maiores que 8 pares de bases (bp) foram denominadas de minissatélites
ou regiões em repetições em tandem longas (LTRs). Aquelas com repetições
da seqüência básica de aproximadamente 2 a 8 bp são denominadas de regiões
microssatélites ou STRs (short tandem repeats) (GOLDFARB, 1986,
JOBIM et alii,
1999).
Os minissatélites são formados por seqüências
de vários nucleotídeos, por exemplo, (ATGCGAGCTACTGAGCC)n, repetidas em números
diferentes em cada indivíduo, dando-lhe uma característica única. Um lócus
de minissatélite pode ter muitos alelos em função do número de vezes (n)
em que esta estrutura é repetida ao longo do DNA, deixando a população
polimórfica em relação ao lócus (JOBIM et alii, 1999;
JEFFREYS et alii,
1985b).
Os loci de microssatélites (STRs)
ou repetições curtas consecutivas se assemelham aos minissatélites, porém
com estrutura repetida menor, como, por exemplo, na seqüência (GATA)n
(JOBIM et alii,
1999; MOLLER & BRINKMANN, 1992).
O número de repetições básicas nos
minissatélites e microssatélites pode variar em diferentes indivíduos
criando um polimorfismo de comprimento (WEEDN & SWARNEN, 1998).
1.2.3.2 Métodos de detecção
O primeiro método de detecção de regiões
polimórficas do DNA denomina-se RFLP (restriction fragment length
polymorphism) ou polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição.
Nas análises clássicas de RFLP, fragmentos de DNA contendo VNTRs (minissatélites)
são cortados do DNA cromossômico por enzimas de restrição. Um
determinado comprimento de fragmento é conhecido como alelo. Assim, são
analisados os fragmentos de corte (restrição) do DNA que diferem (são
polimórficos) em tamanho (comprimento) entre os indivíduos (WEEDN &
SWARNEN, 1998).
O desenvolvimento de sondas de DNA para
os loci VNTR foi a chave para a aplicação das análises de RFLP na
medicina forense.
A sonda original de Jeffreys et
alii (1985a,
1985b), que originou o termo “padrão de impressões digitais de DNA” (fingerprint
of DNA), é uma sonda multilocal (MLP). Uma sonda multilocal liga-se a várias
seqüências de DNA e produz inúmeras bandas; a auto-radiografia resultante
assemelha-se a um código de barras comercial. Os laboratórios atualmente
usam sondas para loci únicos (SLP), que se ligam a um único lócus
do DNA. Os sistemas de SPL são adotados por serem mais sensíveis, mais
facilmente interpretados e por possuírem uma genética definida (JOBIM et alii, 1999).
As sondas RFLP SLP são elaboradas de
modo a se ligarem a uma localização-alvo em cada conjunto cromossômico.
Estas sondas são tipicamente específicas para humanos ou primatas. Os
fragmentos de DNA ligados à sonda variam em tamanho e, portanto, são
visualizados como bandas que variam em posição em uma auto-radiografia.
Geralmente são geradas duas bandas em uma auto-radiografia para cada sonda
de lócus único, correspondendo aos alelos maternos e paternos, a menos que
estes sejam compartilhados (WEEDN & SWARNEN, 1998).
Atualmente, apenas as análises de RFLP
SLP são empregadas e, na grande maioria das vezes, em testes de determinação
de paternidade. Esta técnica é extremamente potente, porém, é laboriosa,
complexa e exige DNA íntegro e em grande quantidade para sua aplicação.
Por estas razões ela não é recomendada para análises voltadas à elucidação
de crimes, devido à escassez e, mormente, ao estado de degradação das
amostras.
Todos os testes de DNA não realizados
por RFLP atualmente em uso baseiam-se em métodos de PCR (Reação em Cadeia
da Polimerase) e incluem os sistemas dotblot, AmpFLPs (polimorfismos
do comprimento amplificado do fragmento de DNA), STRs (repetições tandem
curtas) e seqüenciamento direto do DNA mitocondrial (mtDNA).
A PCR foi descrita pela primeira vez em
1985, por Kary Mullis que, em 1993, recebeu o prêmio Nobel em química por
seu feito. Desde o início, a PCR foi reconhecida como uma resposta em
potencial para quantidade traço de líquido biológico freqüentemente
encontrado na área forense. Amiúde, estas amostras são diminutas para
serem utilizadas com os métodos de RFLP (JEFFREYS et
alii, 1988).
As tecnologias da PCR são principalmente
insensíveis à degradação, uma vez que os loci de DNA-alvo são
pequenos e apenas algumas poucas cópias da seqüência-alvo precisam estar
intactas na amostra de DNA antes da amplificação. As análises por RFLP,
ao contrário, são extremamente sensíveis à degradação uma vez que a
fragmentação do DNA atinge exatamente o cerne do método analítico (WEEDN
& SWARNEN, 1998).
A PCR além de propiciar uma tipagem rápida
do DNA, elimina a necessidade de utilização de southern blot e
radioisótopos, permitindo assim a automação.
A tecnologia da PCR é muito poderosa,
mas tem suas desvantagens. Como um todo, os sistemas genéticos analisados
por PCR são menos discriminatórios (informativos) que os sistemas genéticos
RFLP. Contudo, o poder discriminatório é aceitável tendendo a aumentar
com sistemas adicionais (COMEY, 1988).
Segundo Erlich (1989), a suscetibilidade
à inibição por vários fatores como a porção heme do sangue é uma
outra desvantagem da PCR.
Os fragmentos STR são mais suscetíveis
à análise por instrumental automatizado do que os fragmentos de DNA
maiores de outros sistemas e, por isto, são normalmente empregados nos
laboratórios de ciência forense.
As análises STR não automatizadas
empregam géis de poliacrilamida que são, mormente, corados pela prata para
evidenciação dos fragmentos de DNA. Já as análises automatizadas usam
produto amplificado de DNA marcado com corantes fluorescentes e a leitura e
interpretação de seus géis de eletroforeses se dá automaticamente em
aparelho próprio.
Em outra aparelhagem mais sofisticada, os
fragmentos STR de DNA são detectados na medida da migração no gel através
de um detector. Diferentes fluoroforos, agentes químicos fluorescentes, são
utilizados em uma dada coluna. Além disto, vários fragmentos STR são
suscetíveis a amplificações simultâneas como conjuntos multiplex,
permitindo a detecção simultânea de vários sistemas genéticos. Inúmeros
sistemas STR estão disponíveis e com números suficientes de sistemas genéticos
(8, 12 e até 16) no qual são testados simultaneamente e dos quais se obtém
poderes discriminatórios semelhantes aos alcançados nos testes de RFLP
(Hirata & Hirata, 1998; WEEDN & SWARNEN, 1998; COMEY, 1988).
Além das metodologias citadas para
estudar os polimorfismos de DNA tanto em nível de variação de seqüência
quanto de comprimento, a partir de 1996 ocorreram avanços enormes no
desenvolvimento e utilização de “microchips de hibridização de
DNA”, metodologia esta que poderá tornar-se de escolha no futuro, dada a
sua simplicidade e eficiência. (PENA, 1997).
2. OBJETIVOS
Considerando
o fato de nos últimos anos estarmos prestando serviços junto ao Laboratório
de DNA do Instituto de Criminalística de São Paulo, vamos analisar
procedimentos técnicos para a análise forense de DNA, recomendados por
instituições controladoras de qualidade; e apresentar os procedimentos
adotados pelo Laboratório de DNA do Instituto de Criminalística de São
Paulo, laboratório este voltado especificamente para a identificação de
pessoas e elucidação de crimes.
3. PROCEDIMENTOS
TÉCNICOS PARA ANÁLISE DE DNA
Anteriormente relatamos todas as
metodologias existentes para a análise forense dos polimorfismos de DNA.
Entretanto, devido à baixa qualidade e à exigüidade das amostras biológicas
que costumeiramente aportam em um laboratório de DNA forense voltado à
elucidação de delitos e identificação de pessoas, a metodologia
preferencialmente aplicada é a baseada na análise de STRs através da PCR.
Assim sendo, neste trabalho, centraremos nossa atenção nesta metodologia,
cujos procedimentos envolvem várias etapas que podem ser assim enumeradas:
a) Coleta dos
Materiais;
b) Extração do
DNA;
c) Quantificação
do DNA;
d) Amplificação
do DNA;
e) Análise
Comparativa do DNA das Amostras;
f) Cálculos Estatísticos
e
g) Elaboração de
Relatório das Análises realizadas.
Porém, antes de dissecarmos cada uma
destas etapas, devemos observar o significado das palavras de Weedn &
Swarnen (1998): “Nunca antes uma nova prova científica recebeu desafios
legais intensos e tão altamente debatidos. A evidência do DNA é tão
poderosa que a defesa tem pouco a escolher a não ser atacar as provas com
vigor substancial”.
Para que o poder das provas pautadas em
análises de DNA não se esmaeça no exercício do contraditório, pela
formulação direta ou indireta de quesitos sobre a análise realizada,
devem os analistas de DNA se cercar de cuidados técnicos na realização da
análise e, principalmente, na confecção do laudo pericial, pois será
através desta peça que transparecerá todo o esforço por eles empreendido
na elaboração da prova.
Os laboratórios de análise forense de
DNA devem estabelecer certos procedimentos e indicações para assegurar que
os resultados apresentados aos tribunais sejam válidos e exatos em todas as
instâncias. O laboratório deve assegurar a custódia das alíquotas das
amostras, garantir que os testes sejam realizados de maneira própria, com
reagentes apropriados, por indivíduos qualificados e que os resultados
sejam interpretados por indivíduos experientes (CASKEY et
alii, 1989).
Existem entidades nacionais e
internacionais que são responsáveis indiretas pelo controle de qualidade
das análises forenses de DNA.
Estas entidades formulam recomendações
não só para a correta execução de todos os procedimentos necessários
para a análise de DNA, como também para a confecção de laudos e relatórios.
Na busca deste controle de qualidade,
praticam a aferição externa dos laboratórios a elas filiados através de
testes de proficiência ou acreditação.
Estimulam a padronização de
metodologias de análise e dos loci utilizados. Praticam ainda testes
de validação para empresas fabricantes de reagentes utilizados na análise
forense de DNA.
Dentre as entidades internacionais
podemos citar a européia Sociedade Internacional de Hemogenética Forense
(ISFH); SWGDAM – Grupo Técnico de Trabalho em Métodos de Análise de
DNA, norte-americano coordenado pelo FBI; AABB – Associação Americana de
Bancos de Sangue e o GITAD – Grupo Ibero-americano de Trabalho em DNA.
A
Sociedade Brasileira de Medicina Legal (SBML) editou recentemente algumas
recomendações para laboratórios que realizam testes de paternidade através
de DNA. Trata-se de uma tentativa de normatização de adesão voluntária e
opcional. Formou-se também um Comitê Técnico Especializado de Biologia
Molecular (CTLE 04) do INMETRO para o estudo de parâmetros de sistematização
voltado para a análise de DNA.
O ataque contundente às provas de DNA
será fatalmente praticado se não forem seguidas na análise e na elaboração
do laudo as recomendações sugeridas por estes organismos controladores de
qualidade e de fomento à pesquisa.
Isto posto, passemos, então, a analisar
cada uma das etapas, mormente empreendidas para a análise de DNA, sob a óptica
das análises realizadas no Laboratório de DNA do Instituto de Criminalística
de São Paulo.
3.1 Coleta de Materiais
Segundo BUDOWLE (1996), a qualidade, exatidão e confiabilidade dos
resultados obtidos na análise de DNA em vestígios coletados ou
relacionados a ocorrências criminais depende de procedimentos próprios que
devem ser rigorosamente adotados nas etapas do isolamento do local do delito
e do levantamento das amostras biológicas a serem encaminhadas para a
unidade orgânica responsável pela genotipagem forense no âmbito da
respectiva Instituição.
Logo, o tipo, a integridade e a preservação dessas amostras constituem-se
em fatores essenciais à consecução de perfis genéticos bem
caracterizados e definidos, pré-requisito para produção de laudos
periciais de excelente nível técnico-científico Assim, a técnica usada
na coleta e documentação da evidência, sua natureza e quantidade, bem
como seu acondicionamento e encaminhamento, são alguns dos pontos críticos
para um programa de execução dos exames de material genético.
O desenvolvimento da Biologia Molecular e a estabilidade química e térmica
do ácido desoxirribonucléico, mesmo após longo período de tempo - meses,
e, às vezes, anos permitem a obtenção de padrões genéticos
individuo-específicos que podem ser comparados com aqueles das vítimas
e/ou suspeitos de casos de infração penal. As condições e disposição
das diversas amostras biológicas no local possibilitam reconstituir com
bastante exatidão e segurança a dinâmica do evento criminal, derivada da
atividade pericial forense, no que se refere, dentre outros casos, a:
- identificação
de suspeitos em casos de crimes sexuais (estupro atentado violento ao pudor,
ato libidinoso diverso de conjunção carnal e outros);
- identificação
de cadáveres carbonizados e em decomposição (restos mortais, ossadas e
outros);
- identificação
de cadáveres mutilados;
- identificação
de partes e órgãos de cadáveres;
-
estabelecimento de relação entre instrumentos lesivos e vítimas,
por produção de perfis de DNA recuperado e produzido a partir de material
biológico (sangue, esperma, pêlos, pele e outros) presente em anteparo ou
objeto encontrado em local de crime ou a ele relacionado;
- investigação
de paternidade nos casos de gravidez resultante de estupro;
- estudo de vínculo
genético (investigação de paternidade, anulações de registros civis de
nascimento, raptos e seqüestros de crianças, tráfico de menores e
outros);
- identificação
de cadáveres abandonados nos casos de aborto provocado, em casos de
infanticídio e de falta de assistência ao parto.
Podemos, ainda, ressaltar a gama de material biológico que pode ser
utilizado na determinação do perfil genético: sangue, esperma, secreções,
saliva, urina, tecidos moles, pêlos e anexos dérmicos, dentes, ossos e
outros, recolhidos ou correlacionados a ocorrências criminais de interesse
forense.
Vale mencionar também que evidências físicas sofrem normalmente insultos
ambientais (luz, elevadas temperaturas, reativos químicos, substâncias
corrosivas, ataque enzimático, contaminação/degradação por
microorganismos, com conseqüentes quebras e outras alterações da cadeia
de polinucleotídeos) que modificam a composição e a estrutura normal de
seu DNA. Essas evidências estão ainda sujeitas às mais diversas formas de
contaminação por material genético exógeno, derivado de outros seres
humanos que não necessariamente estão ligados à cadeia de eventos do ato
delituoso em questão.
Logo, esses vestígios devem ser devidamente identificados em:
-
amostras-questionadas: são aquelas evidências derivadas do local da infração
penal, de objetos relacionados a ocorrências criminais ou de quaisquer
outros pontos, e cujas origens sejam não-determinadas/conhecidas; e
-
amostras-referência: são aquelas evidências oriundas de vítimas,
suspeitos, acusados, réus ou de seus parentes consangüíneos – pai, mãe
irmãos, filhos, isto é, são amostras de identidade (quanto à procedência)
conhecida.
Assim disposto, entende-se que a genotipagem forense presta-se, no núcleo
principal de sua finalidade, a estabelecer os correspondentes vínculos genéticos
entre amostras-questionadas e amostras-referência, concluindo-se pela
determinação da origem individual de cada evidência e, a partir desse
ponto e mesmo coligado a outros meios de prova, eventualmente reconstruir
parcial ou totalmente a dinâmica do ato infracional.
Devido ao usual exercício do contraditório
por parte da defesa com argumentos contra a admissão da validade dos
resultados dos testes de DNA no processo, é imperativo que os centros
forenses mantenham a cadeia de custódia de amostras, através de registros
que possam acompanhar as amostras a partir da coleta e através da
interpretação dos resultados. O laboratório deve ser hábil para
demonstrar que tomou todas as precauções para prevenir a falsificação,
quebra, perda ou contaminação da amostra (CASKEY et
alii, 1989;
MACHADO, 1996; MADISEN et
alii, 1987).
Frente à necessidade de adoção dos
cuidados devidos e dada a importância vital da correta manipulação das
amostras biológicas para o sucesso das análises, visando minimizar infortúnios,
o Instituto de Criminalística, baseado em recomendações nacionais
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA LEGAL, 1999) e internacionais (BUDOWLE,
1996; COMMITTEE ON DNA TECHNOLOGY IN FORENSIC SCIENCE, 1993; FEDERAL
BUREAU OF INVESTIGATION, 1998; INTERNATIONAL SOCIETY FOR FORENSIC
HAEMOGENETICS, 1998, 1989, 1992a, 1992b; VON BEROLDINGER et
alii, 1989),
forneceu elementos técnicos necessários para a edição da Resolução no.
194, pela Secretaria de Segurança Pública,
estabelecendo normas para coleta e exame de materiais biológicos para
identificação humana.
É interessante destacar que o art. 6º
desta Resolução prevê a existência de um Termo de Coleta de material
biológico de pessoa viva que deverá ser lavrado perante testemunhas. Nele
estará contida a declaração do doador de não haver recebido transfusão
sangüínea nos últimos 90 dias ou ter se submetido a transplante de medula
óssea, pois, caso contrário, haveria, na amostra de sangue colhida,
mistura de material genético, alheio ao do doador, o que comprometeria a análise.
Devem ser colhidas duas amostras de sangue periférico, em respeito ao art.
170 do Código de Processo Penal que prevê a necessidade de reserva de
material para eventual contra-prova, bem como em respeito às boas práticas
laboratoriais.
É prevista ainda neste Termo a declaração
de que o doador está fornecendo o material de livre e espontânea vontade.
Este previsão leva em conta o princípio nemur tenetur se detegere,
um dos princípios do Processo Penal ligado ao Devido Processo Legal,
previsto no inciso LIV do art. 5º da Constituição da República
(TORNAGHI, 1988; DAMÁSIO, 1989). Entende-se que o acusado deve evitar se
auto-acusar, não estando obrigado a fazer prova contra si mesmo.
Por último, em respeito ao mesmo princípio,
deverá constar do Termo de Doação a declaração do órgão coletor de
que o material biológico colhido será utilizado única e exclusivamente
para exames relacionados com a ocorrência criminal que se está apurando e
não em outras passadas ou futuras.
3.2 Extração do DNA
É a etapa mais dificultosa e, portanto,
morosa, devido à escassez e degradação do material por contaminação de
fungos e bactérias e, na maior parte das vezes, sujeito à exposição da
luz solar e intempéries ou por se tratar de partes de cadáver em decomposição.
Nesta etapa são gastos dias, às vezes,
semanas ou meses. É esta dificuldade que vai diferenciar a análise de DNA
realizada em um laboratório de DNA forense daquelas desenvolvidas em
laboratórios particulares, voltadas à determinação de paternidade, onde
existe abundância de sangue e em ótimo estado de conservação.
De modo geral, o que se busca na extração
é retirar o DNA do núcleo das células e purificá-lo. O método químico
utilizado para isto vai depender do tipo e da forma de apresentação da
amostra a ser analisada.
As metodologias de extração empregadas
no Laboratório de DNA do Instituto de Criminalística de São Paulo são
principalmente baseadas nas recomendações do FEDERAL BUREAU OF
INVESTIGATION (1994) e FORENSIC SCIENCE SERVICE DNA PROFILING (1992),
devidamente modificadas e adaptadas aos recursos materiais existentes. São
métodos clássicos que, de modo geral, podemos assim elencar: método orgânico
(fenol-clorofórmio) ou chelex para a extração de DNA em manchas, swabs,
ossos e pêlos e cabelos com bulbos; iodeto de sódio, chelex e salting-out
para sangue, além de reagentes purificantes como DNA-IQ.
3.3 Quantificação do DNA extraído
Esta etapa tem como objetivo a obtenção
de parâmetros para o balanceamento químico da etapa posterior, reação de
amplificação do DNA.
De modo geral, as metodologias empregadas
para a quantificação são baseadas em diluições do material extraído
que pode ser evidenciado em géis de agarose com brometo de etídio; por
espectrofotometria ou pelo sistema slot blot por quimioluminescência.
A quantificação de DNA em gel de
agarose é técnica de menor precisão quando comparada às outras, porém
de grande valia por sua simplicidade, sendo ágil instrumento para demonstração
de êxito na etapa de extração.
Através do sistema slot blot por
quimioluminescência, é possível proceder-se à quantificação do DNA por
hibridização com a sonda D17Z1, específica para primatas superiores e,
com isto, verificar se o DNA extraído é humano ou não (KOBILINSKY, 1992;
BUDOWLE, 1996).
O método espectrofotométrico de
quantificação de DNA é geralmente utilizado para determinar a concentração
e pureza de ácidos nucléicos em uma solução. O laboratório de DNA do
Instituto de Criminalística emprega esta metodologia e utiliza para a
quantificação de suas amostras um espectrofotômetro GeneQuant - RNA/DNA
Calculator, da marca Pharmacia Biotech e gel de agarose 0,7% e coradas com
brometo de etídio.
3.4 Amplificação do DNA
A PCR – Reação em Cadeia da
Polimerase - é um método extremamente poderoso na avaliação da
individualização humana. Ela permite a amplificação seletiva, in
vitro, de seqüências específicas do DNA alvo que se deseja estudar. O
princípio da reação está no conhecimento da seqüência do DNA alvo e em
reação bioquímica complexa. A ciência básica forneceu as seqüências
das regiões de centenas de microssatélites de importância em hemogenética
forense. Os loci de microssatélites conhecidos por STRs apresentam
alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 300 pares de bases e são os preferidos
na análise pericial de casos de identificação humana em que a amostra é
escassa ou parcialmente degradada (JOBIM et
alii, 1999;
MULLIS & FALOONA,
1987; HOCHMEISTER, 1998).
Vamos expor, de forma bem simplificada e
sucinta, sob a óptica de BAR et
alii, 1997,
como se dá esta multiplicação ou amplificação de regiões específicas
de DNA.
Em um microtubo são colocados os seguintes componentes:
- água;
- tampão com magnésio;
- dNTPs ou nucleotídeos que contém as bases nitrogenadas
adenina, timina, citosina e guanina, matéria-prima a ser empregada na síntese
de DNA;
- Taq-DNA-polimerase, enzima polimerizante e termoestável,
responsável síntese de DNA;
- iniciadores da reação chamados primers que irão
parear especificamente na região alvo (lócus) do DNA que se quer
multiplicar; e, obviamente,
- o DNA alvo que foi extraído do vestígio que ser quer
analisar através de sua multiplicação.
Esta reação de amplificação do DNA
dar-se-á através de um aparelho denominado termociclador. Este aparelho
automaticamente propiciará que, através da programação apropriada de
repetidos ciclos de variação de temperatura, se dê, no interior do
microtubo, a amplificação da região específica (lócus) do DNA (INNIS et
alii, 1992).
Nesta reação, cada ciclo é composto de
três passos. No primeiro chamado de etapa de desnaturação que se dá a 94oC,
existe a separação das fitas do DNA molde.
No segundo passo, conhecido como etapa de
anelamento, entre 40o e 60oC, dar-se-á o pareamento
ou ligação dos iniciadores (primers) ao início da região específica
(lócus) em ambas as fitas do DNA que se quer copiar.
No terceiro e último passo, conhecido
como etapa de extensão, a 72oC, dá-se a atuação da
Taq-DNA-polimerase que propiciará o pareamento dos nucleotídeos livres, a
partir dos iniciadores, às fitas do DNA molde.
Segundo Hirata & Hirata (1998), sob
condições teóricas, os produtos de PCR dobram de número a cada ciclo.
Desta forma, se, hipoteticamente, o número inicial de moléculas de DNA
fosse 1, ao final do primeiro ciclo teríamos 2 moléculas amplificadas. Ao
final do segundo ciclo 4 moléculas, do terceiro ciclo 8 moléculas e assim
sucessivamente, de modo que a repetição destes ciclos, entre 25 e 35
vezes, leva à amplificação exponencial da região alvo, ou seja, do lócus
que se quer estudar, alcançando-se bilhões de cópias (ZAHA, 1996).
Os loci analisados através da reação
de PCR são muitos. Estes loci podem ser analisados individualmente
ou em grupos, através de sistemas chamados múltiplos ou
"multiplex" que permitem o estudo simultâneo de diversos loci.
Independentemente da forma de análise,
dentre os loci mais comumente empregados nos estudos forenses de DNA
destacam-se, entre outros, vWA, D8S1179, TPOX, FGA, D3S1358, TH01, D21S11,
D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF e Penta D.
A amelogenina é um dos loci
utilizados que permite, através da técnica da PCR, identificar o sexo de
um indivíduo que tenha deixado determinado vestígio biológico (AKANE et
alii, 1991;
1992).
Foram descritos alguns loci de
STRs do cromossomo Y que têm sido empregados no esclarecimento de crimes
sexuais em que existam secreções misturadas. É possível, através da análise
dos loci deste cromossomo, presentes nos espermatozóides da secreção
vaginal da vítima, identificar o estuprador de forma inequívoca, pois o
material feminino da mistura em nada interferirá. De acordo com Jobim et
alii (1999), os principais loci deste sistema são: DYS19; DYS389 I
e II; DY390, DYS391; DYS392 E DYS393. O Instituto de Criminalística de São
Paulo vem promovendo estudos e testes para introdução deste sistema para
auxiliar na rotina de trabalho do Laboratório de DNA, voltada à elucidação
de crimes sexo-relacionados.
3.5 Análise comparativa
Segundo JOBIM et alii (1999),
pode-se evidenciar os fragmentos de DNA (loci) amplificados de duas
maneiras:
1) através de bandas em gel de poliacrilamida, reveladas
por prata ou detecção do sinal fluorescente dos primers marcados
por fluorocromos; ou
2) através da
detecção por seqüenciador automático, onde se evidenciam picos de DNA.
Em nosso laboratório, a metodologia
ainda utilizada é a visualização do DNA através de bandas em gel de
poliacrilamida, reveladas por coloração em prata e detecção do sinal
fluorescente dos primers marcados por fluoroforos e através da detecção
por seqüenciador automático.
Para as análises comparativas, quando não trabalhamos com
o seqüenciador automático, as amostras amplificadas são submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida, o que propicia a separação do DNA
em bandas de acordo com seu peso molecular (tamanho da seqüência
repetitiva do DNA).
Para detecção precisa do peso
molecular, ou seja, do número de pares de bases indicativo de cada alelo,
é aplicado, ao lado das amostras, um padrão, denominado ladder.
3.6 Cálculos estatísticos
Os marcadores genéticos, incluindo DNA e
marcadores sorológicos, não identificam positivamente um indivíduo. Ao
contrário, são utilizados ou na exclusão positiva de um indivíduo ou no
estabelecimento de uma provável origem.
O DNA pode ser exclusivo de um indivíduo,
mas a gama total de polimorfismos não é testada e conseqüentemente existe
uma certa probabilidade estatística de que dois indivíduos, escolhidos ao
acaso, venham a ter um perfil semelhante de DNA (EVETT & WEIR, 1996).
Os cálculos desta probabilidade
baseiam-se em dados de freqüência de populações e são analisados com
conceitos estatísticos de genética de populações. O princípio de
Hardy-Weinberg, uma expressão matemática para sistemas dialélicos: p2
+ 2pq + q2 = 1, utilizada para calcular a freqüência de um
alelo em uma população, indica que a freqüência dos alelos permanece
constante em uma população ao longo do tempo, pressupondo cruzamentos ao
acaso na população (BEIGUELMAN, 1996, 1994; Weedn & Swarnen, 1998).
Uma vez identificados os alelos para os loci
estudados, deverá ser feita a interpretação, para cada lócus, em termos
de inclusão ou exclusão do indivíduo pela comparação de seus alelos com
os da amostra ou amostras questionadas.
Em casos de estudos de, por exemplo,
comparação entre manchas de sangue encontradas na vestimenta de um
suspeito e material biológico pertencente à vítima, deverá haver, caso a
mancha de sangue realmente pertencer à vítima, coincidência, ou seja,
inclusão de todos os alelos, para todos os loci analisados.
Para casos como estes, far-se-ão cálculos
para mensuração da razão de verossimilhança entre as amostras
analisadas. Este grau de semelhança é medido pela freqüência de incidência
que representa o número de vezes em que determinado perfil genético ocorre
na população (EVETT & WEIR, 1996).
Na análise forense de DNA é corriqueiro
o emprego do cálculo da razão de verossimilhança, como, por exemplo, em
casos de determinação de autoria de estupro ou comparação de manchas
colhidas em local de crime e amostras de sangue de suspeitos ou vítimas.
Os resultados dos cálculos da freqüência
de incidência de um determinado perfil genético em uma população são
normalmente expressos com notações que indicam o número de vezes em que o
perfil se repete na população, por exemplo, 1 em 5 bilhões de pessoas ou
1 em 20 bilhões de pessoas (WEIR, 1996).
Segundo OTTO et alii (1982), se se tratar de um caso de
paternidade, para cada lócus, deverá haver coincidência entre um dos
alelos da criança com um dos presentes em sua mãe. O outro alelo da criança,
não coincidente com a mãe, deverá estar presente no pai e este alelo
recebe o nome de alelo paterno-obrigatório.
Analisando-se os alelos do suposto pai,
dir-se-á que existe inclusão deste para o lócus se ele possuir o alelo
presente na criança, dito, alelo paterno-obrigatório. Caso contrário
existirá sua exclusão para este lócus.
A exclusão de paternidade é declarada
quando o suposto pai não apresenta em seu material genético três alelos
ou mais dos alelos paterno-obrigatórios, definidos para o investigante
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA LEGAL, 1999).
Na análise forense de DNA, recomenda-se
o estudo de loci com grande polimorfismo, mas com baixa freqüência
de mutação, e também com elevado índice de heterozigose e poder de
discriminação (JOBIM et
alii, 1999).
Quanto mais raro for um alelo na população,
maior a evidência em favor da inclusão. Se este alelo for comum na população,
a evidência torna-se significativamente menor.
Nos estudos de paternidade que se dão
através da análise de amostras de sangue colhidas da mãe, da criança e
do suposto pai, mormente voltadas para esclarecimentos de causas cíveis de
direitos sucessórios ou de alimentos, o número recomendável de loci
a serem analisados, para obtenção de resultados seguros, dependerá da técnica
empregada. No caso de sondas, por serem mais informativas, é aceito um número
entre 4 e 6. Já para as análises efetuadas com o emprego de STRs, o número
de loci analisados deverá ser maior que 12 (PENA, 1997; SOCIEDADE
BRASILEIRA DE MEDICINA LEGAL, 1999).
Nas análises forenses de DNA, voltadas
à elucidação de crimes ou à identificação de pessoas, que na grande
maioria das vezes emprega STRs, o número de loci utilizados para
obtenção de resultados poderá ser menor, uma vez que, dada a baixa
qualidade dos materiais biológicos que são analisados, nem sempre se obtém
sucesso na amplificação para muitos loci (PENA, 1997).
Segundo BEIGUELMAN (1996), a
probabilidade de paternidade é calculada a partir do índice de paternidade
e representa a possibilidade de o suposto pai ser o pai biológico.
O índice de paternidade é verificado
por meio da razão entre a probabilidade das bandas, pertinentes ao perfil
genético do filho ou filha e que estejam em coincidência com o perfil do
suposto pai, serem oriundas deste suposto pai e a probabilidade delas serem
oriundas de qualquer indivíduo da população.
A análise de DNA voltada à determinação
da paternidade leva ainda em conta a probabilidade de exclusão. Este cálculo
indica a probabilidade de não encontrarmos um outro indivíduo, selecionado
ao acaso na população, que possua o mesmo perfil genético do pai biológico
da criança. Nesta análise são considerados somente os alelos da mãe e da
criança.
Os resultados dos cálculos de
probabilidade de paternidade e probabilidade de exclusão são normalmente
expressos em valores percentuais, geralmente com índices próximos a
99,99%.
As freqüências alélicas utilizadas
para os cálculos estatísticos da análise de DNA variam entre as populações.
Vários pesquisadores vêm formando um banco de dados representativo da
população brasileira, o que vem contribuindo para o aprimoramento das
estimativas de probabilidade.
Pode-se, entretanto, minorar os riscos
das imprecisões oriundas de cálculos probabilísticos efetuados com dados
de populações estrangeiras através da utilização de um método
denominado freqüência teto, onde é considerado o limite máximo de ocorrências
de um alelo, qualquer que seja a origem étnica de uma pessoa (FRANÇA,
2000).
3.7 Elaboração de laudo ou relatório
Todas as etapas empreendidas para o
estudo do DNA, desde a coleta até a interpretação do significado estatístico
dos dados obtidos, serão consubstanciadas em uma peça pericial escrita que
servirá aos interesses de seus leitores.
Um relatório de análise de DNA poderá
fornecer subsídios para auxiliar, por exemplo, na conclusão do laudo do
Perito Criminal que o solicitou. Ou, então, subsidiar informações
importantes a um Médico Legista responsável pela identificação de um cadáver
em decomposição.
Um laudo de análise de DNA poderá
auxiliar diretamente a Autoridade Policial no esclarecimento de pontos
nebulosos de um inquérito policial. Em instância final, poderá ainda
servir como elemento de convicção para Juízes, Promotores e Advogados nas
ações penais.
Dentre
as mínimas recomendações, apregoadas pela SOCIEDADE BRASILEIRA DE
MEDICINA LEGAL (1999) e pela SOCIEDADE INTERNACIONAL DE HEMOGENÉTICA
FORENSE (1992a, 1992b), para a elaboração de um laudo pericial de análise
de DNA, podemos citar o seguinte conteúdo: identificação do número do
inquérito policial ou processo; identificação das partes; informação da
etnia (raça) dos envolvidos, quando possível; citação da metodologia
empregada na coleta e armazenamento de materiais e, se necessário,
esclarecer os cuidados empreendidos para manutenção da cadeia de custódia
destes materiais.
Deverá ainda o laudo conter informações
bibliográficas sobre as metodologias utilizadas para a extração,
quantificação e amplificação do DNA; forma de leitura dos alelos obtidos
nos testes; fórmulas empregadas para os cálculos estatísticos. Se possível,
deverão ser incluídas fotografias dos testes realizados. Deverá ser
utilizada a nomenclatura oficial na identificação dos alelos, como também
a inclusão de suas freqüências.
4. RESULTADOS
Desde março de 1999, sob a orientação
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, o
Instituto de Criminalística de São Paulo disponibilizou oficialmente aos
Peritos Criminais e aos Médicos Legistas do Estado de São Paulo os serviços
de seu Laboratório de DNA.
Dentre os serviços já prestados por
este Laboratório, podemos destacar, além das análises de DNA propriamente
ditas, o fornecimento de subsídios técnicos para a edição da Resolução
SSP n° 194, pioneira em nível nacional e quiçá sul-americano, dando as
diretrizes para Peritos Criminais e Médicos Legistas procederem à coleta,
acondicionamento e preservação de materiais biológicos destinados à análise
de DNA.
Um recente estudo estatístico apontou
que até abril de 2004 dos mais de 1.200 casos recebidos pelo Instituto de
Criminalística, 40% dizem respeito a crimes sexo-relacionados; 40% a
identificação de cadáveres e 20% a outros crimes, sendo 51% destes casos
oriundos da Grande São Paulo e 49% deles do restante do Estado. Obteve-se
êxito nas análises em 60% dos casos que foram concluídos.
5. COMENTÁRIOS
Tanto
em nossas análises, bem como na elaboração de nossos laudos e relatórios,
seguimos as recomendações apregoadas pela SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA
LEGAL (1999) e pela SOCIEDADE INTERNACIONAL DE HEMOGENÉTICA FORENSE (1992a,
1992b) até o limite dos recursos disponíveis no Laboratório de DNA do
Instituto de Criminalística.
FRANÇA (2000), em um excelente artigo,
aborda acerca da mística formada em torno do DNA. Alude o autor sobre a
difusão errônea da idéia de infalibilidade da prova de DNA, fazendo
grassar a falsa expectativa de alcance quase infinito desta prova, que se
mal elaborada pode levar a erros judiciais, muitas vezes irreparáveis.
O autor reconhece e ressalta a importância
do emprego do DNA, porém questiona se seus resultados apresentam a condição
de certeza absoluta e de fato inquestionável, face à falta de controle de
qualidade e estudos neste assunto.
Dentre as justificativas
apresentadas pelo autor para pautar a mistificação do DNA está a
desconsideração da pouca experiência nacional neste setor e o
negligenciamento das reais condições das estruturas médico-legais de
nosso país. Acrescenta a desconsideração de que, em muitas de nossas
localidades, há uma predominância muito acentuada de casamentos consangüíneos
e, tal fato, traz maior margem de erro estatístico. Argumenta ainda acerca
da falta do devido cuidado que merece tudo aquilo que é atual e inusitado,
incitando a exclusão das provas tradicionais pelo simples fato de serem de
prática mais antiga.
Gostaríamos de acrescentar às observações
do autor, no sentido da desmistificação do assunto, as limitações do
alcance da análise de DNA.
No caso de gêmeos idênticos serem suspeitos de um crime em
que o autor deixou vestígios, o DNA em nada poderia colaborar para a
elucidação do delito, uma vez que não consegue distingui-los por serem
geneticamente idênticos, ao passo que a papiloscopia sim, se dentre os vestígios
existissem impressões digitais.
As condições de preservação do
material biológico de um cadáver carbonizado ou de um cadáver que tenha
ficado por muito tempo submerso no mar, muitas vezes não permitem, através
da análise de DNA, que se alcancem dados com significância estatística
para que se possa afirmar sobre sua identidade, ao passo que o exame de sua
arcada dentária possa ser muito mais significativo neste sentido.
Outro ponto importante a ser abordado nas
limitações da análise de DNA, principalmente na área criminal, diz
respeito à peculiaridades da análise. Características intrínsecas a cada
vestígio biológico muitas vezes se tornam barreiras intransponíveis como,
por exemplo, a inibição da reação de PCR para materiais oriundos de
algumas vestimentas coloridas com índigo ou raspados de um cinto de couro
e, por isto impregnados de taninos.
Pela complexidade da análise e dada a
existência de inúmeras variantes que podem atuar como fatores limitantes,
além, obviamente, da já tão debatido fator de condição de preservação
dos vestígios, deve ficar claro aos que solicitam exames de DNA que a
obrigação assumida pelo laboratório é uma obrigação de meio e não de
resultado.
Pelas lições de Monteiro (1989),
podemos inferir que os analistas de DNA obrigam-se a empregar diligência e
a se conduzir com prudência para atingir a meta colimada pelo exame, porém
sem poder garantir que alcançarão o resultado esperado pelo requisitante,
tal qual um médico que se compromete a cuidar de um enfermo ou um advogado
a quem se confia o patrocínio de uma causa.
Apesar de todas as pontuações que
fizemos acerca das limitações da análise de DNA, devemos, acima de tudo,
ressaltar sua importância como prova extremamente poderosa, se realizada
segundo as recomendações técnicas que aqui foram discutidas.
Bem realizada, a prova pautada na análise
de DNA será contundente e robusta, só restando à defesa o seu ataque. As
alegações da defesa provavelmente voltarão o foco das atenções para a
interpretação estatística, erros de taxas, o controle de qualidade das análises
e, no caso de PCR, questões de contaminação.
Porém, entendemos que tais alegações não
devam ser negativamente interpretadas pelos analistas de DNA, mas sim como
forma de desafio e estímulo para a excelência da prática forense.
Apesar do ferrenho exercício do
contraditório que esta prática suscita, os tribunais reconhecerão que as
evidências de DNA são mais confiáveis do que as testemunhas oculares e
outras provas subjetivas ou muito menos poderosas.
6. REFERÊNCIAS
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